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ELISA的原理与分类
浏览次数:119发布日期:2019-12-30

一、ELISA的原理
ELISA的根底是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶符号。结合在固相载体外表的抗原或抗体仍坚持其免疫学活性,酶符号的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测守时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体外表的抗原或抗体起反响。用洗刷的办法使固相载体上构成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分隔。再加入酶符号的抗原或抗体,也经过反响而结合在固相载体上。此刻固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的份额。加入酶反响的底物后,底物被酶催化成为有色产品,产品的量与标本中受检物质的量直接相关,故可依据呈色的深浅进行定性或定量分析。因为酶的催化功率很高,间接地扩大了免疫反响的结果,使测定办法达到很高的敏感度。
 

二、ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定办法中有三个必要的试剂:(1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶符号的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反响的底物。依据试剂的来历和标本的状况以及检测的具体条件,可规划出各种不同类型的检测办法。用于临床查验的ELISA主要有以下几种类型:
 

1.双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原zui常用的办法,操作过程如下:
1)将特异性抗体与固相载体联合,构成固相抗体。洗刷除掉未结合的抗体及杂质。
2)加受检标本,保温反响。标本中的抗原与固相抗体结合,构成固相抗原抗体复合物。洗刷除掉其他未结合物质。
3)加酶标抗体,保温反响。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗刷未结合的酶标抗体。此刻固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产品。经过比色,测知标本中抗原的量。
 

2.双抗原夹心法测抗体
反响形式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因而其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常选用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应依据抗原结构的不同,寻找适宜的符号办法。
 

3.间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的办法。其原理为使用酶符号的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体。
 

4.竞赛法测抗体
当抗原材猜中的搅扰物质不易除掉,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞赛与固相抗原结合。标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因而阳性反响呈色浅于阴性反响。如抗原为高纯度的,可直接包被固相。

如抗原中会有搅扰物质,直接包被不易成功,可选用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,构成固相抗原。洗刷除掉抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞赛结合反响。竞赛法测抗体有多种形式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞赛结合,抗HBc ELISA一般选用此法。另一种形式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞赛结合,洗刷后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反响。抗HBe的检测一般选用此法。
 

5.竞赛法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺少可作夹心法的两个以上的位点,因而不能用双抗体夹心法进行测定,能够选用竞赛法形式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞赛与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,zui后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
 

6.捕获包被法测抗体
IgM抗体的检测用于流行症的前期确诊中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体,后者将竞赛结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因而如用抗人IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除掉IgG的搅扰。

在临床查验中测定抗体IgM时多选用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶符号针对抗原的特异性抗体。再与底物作用,呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的前期确诊。甲型肝炎病毒(HAV)抗体的检测形式见图2-7。类风湿因子(RF)同样能搅扰捕获包被法测定IgM抗体,导致假阳性反响。因而中和IgG的间接法近来颇受青睐,用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。
 

7.ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)体系(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白,分子量60000,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物,分子量244。用化学办法制成的衍生物素- 羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子构成生物素符号产品,符号办法较为简洁。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性,其亲和力较抗原抗体反响大得多,两者一经结合就极为安稳。因为一个亲和素可与 4个生物素分子结合,因而如把ABS与ELISA法可分为酶符号亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两种类型。

两者均以生物素符号的抗体(或抗原)代替原ELISA体系中的酶标抗体(抗原)。在LAB 中,固相生物素先与不符号的亲和素反响,然后再加酶符号的生物素以进一步进步敏感度。在前期,亲和素从蛋清中提取,这种卵亲和素为碱性糖蛋白,与聚苯乙烯载体的吸附性很强,用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点,在ELISA使用中有替代前者的趋势。因为ABS-ELISA较一般ELISA多用了两种试剂,增加了操作过程,在临床查验中ABS-ELISA使用不多。

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